微生物菌的扩繁发酵流程核心为四步：菌种活化→种子逐级扩大→发酵培养→后处理，：

一、菌种活化

从-80℃甘油管或沙土管中无菌取出菌种，接种至LB/NB斜面培养基，30~37℃培养24~48 h。要求镜检菌体形态均匀、无杂菌。若为芽孢菌需延长培养至5~7天，确保芽孢率≥80%。

二、种子逐级扩大

为发酵罐提供足够数量的纯种细胞，通常采用2~3级扩大：

• 一级种子（摇瓶）：斜面→500 mL三角瓶（装液量50~100 mL），180~200 rpm，培养12~24 h，活菌数达10⁸~10⁹ CFU/mL。

• 二级种子（种子罐）：以5%~10%接种量接入种子罐（装液量50%~70%），通气量1~1.2 vvm，搅拌120~200 rpm，30~37℃培养12~24 h，活菌数达10⁹~10¹⁰ CFU/mL。

• 放线菌等生长慢的菌种需三级扩大；细菌等繁殖快的一般二级即可。种子培养基要求营养丰富且接近发酵培养基，以缩短延滞期。

三、发酵培养（核心环节）

种子液以5%~10%接种量接入发酵罐（装液量60%~70%），根据目标产物灵活控制供氧：

• 好氧阶段（产菌）：通气量1~1.2 vvm，搅拌120~200 rpm，溶氧≥20%，促进快速增殖。

• 厌氧/微氧阶段（产代谢物）：停止通气或降至0.1~0.3 vvm，密封发酵。

培养温度30~37℃，过程中通过在线pH计监控，pH偏低加氨水、偏高流加葡萄糖调节，同时添加消泡剂控泡。培养24~72 h，以活菌数或产物浓度达终点。

四、后处理与制剂加工

发酵液经离心（5000~10000 rpm，15 min）收集菌体。制菌粉：菌泥与脱脂乳、海藻糖等保护剂混合，真空冷冻干燥至水分≤3%，活菌数可达10¹⁰~10¹² CFU/g。制菌液：直接分装或浓缩后添加保护剂。

核心控制点：全程严格无菌；种子活力是发酵成功的前提；溶氧与pH是两个*关键的实时调控参数，切换时机直接决定产物收率。